Equazione di Michaelis-Menten

Le basi della cinetica enzimatica furono poste dalla teoria di Michaelis-Menden che elaborarono un modello che appare idoneo per l’interpretazione delle caratteristiche delle reazioni enzimatiche. Tale teoria si basa sui seguenti punti:
1)        La velocità della reazione dipende sia dalla concentrazione del substrato che da quella dell’enzima; quando il substrato ha saturato completamente l’enzima presente, formando il complesso enzima substrato, la velocità raggiunge un valore massimo, e un ulteriore aumento della concentrazione del substrato non porta ad un aumento della velocità di reazione
2)       L’enzima E reagisce dapprima con il substrato S, per dare il complesso ES secondo una reazione reversibile:
                   

K₁

E + S ⇌      ES

                                                                K_-1                                                             

in cui:
K₁ = costante specifica di velocità della reazione diretta
K₂ = costante specifica di velocità della reazione inversa
3)       A sua volta il complesso ES si decompone, trasformandosi nei prodotti finali P e liberando l’enzima nella sua forma primitiva E: si trascura in questo caso la reazione inversa, che avviene con velocità minima, essendo minima la quantità di prodotto nello stadio iniziale:
K₂
ES → E + P
In cui K₂= costante specifica di velocità
Il processo globale consiste quindi di due reazioni consecutive, per la prima delle quali esiste uno stato di equilibrio:
E + S ⇌ ES →E + P   (2)
4)      Durante la reazione, la concentrazione del prodotto intermedio ES raggiunge un valore costante ( ipotesi dello stato stazionario): è quindi tale valore che determina la velocità di formazione dei prodotti finali
Esaminiamo nei dettagli tutto il processo. La formazione del complesso ES avviene secondo la reazione (1) diretta, e la sua velocità di formazione sarà:
V _formazione = K₁[E][S]
Il complesso ES a sua volta si dissocia secondo la (1) inversa e la (2), per cui la velocità di dissociazione sarà:
V _{dissociazione} = K _-1 [ES] + K₂[ES] = ( K_-1 + K₂) [ES]
In condizioni stazionarie, la velocità di formazione di ES uguaglia la velocità di decomposizione:
K₁[E][S] = ( K_-1 + K₂) [ES]          (3)
Poiché [E] rappresenta la concentrazione dell’enzima libero, ed [ES] la concentrazione dell’enzima combinato, la loro somma darà la concentrazione totale dell’enzima [E]_o
[E] + [ES] = [E]_o
Da cui:
[E] = [E]_o – [ES]
E, sostituendo nella (3), si ha:
K₁ ([E]_o – [ES]) [S] = ( K_-1 + K₂) [ES]
Da cui:
K₁ [E]_o[S] – K₁ [ES][S] = ( K_-1 + K₂) [ES]
moltiplichiamo  per -1 ambo i membri dell’equazione:
-K₁ [E]_o[S] + K₁ [ES][S] = – ( K_-1 + K₂) [ES]
Riordiniamo:
K₁ [ES][S] + ( K_-1 + K₂) [ES]= K₁ [E]_o[S]
Raccogliendo e ricavando [ES]:
[ES] = K₁ [E]_o[S]/ K₁[S] + K_-1 + K₂
Abbiamo quindi ottenuto la concentrazione di ES in funzione delle concentrazioni del substrato e dell’enzima totale e delle costanti di velocità.
Quindi la velocità di formazione del prodotto sarà:
V = – d[ES]/dt = K₂[ES]=  K₂  K₁[E]_o[S]/ K₁[S] + K_-1 + K₂
Dividendo numeratore e denominatore per K₁ si ha:
V = K₂[E]_o[S]/ K_-1 + K₂/K₁  + [S]
Il rapporto K_-1+ K₂/K₁ viene indicato con K_M ( costante di Michaelis-Menden) da cui:
V = K₂[E]_o[S]/K_M + [S] detta equazione di Michaelis-Menden
Tale equazione permette di calcolare la velocità della reazione  funzione della concentrazione del substrato [S] per una data concentrazione di enzima [E]_o: in un grafico, tale funzione ha l’andamento di un’iperbole come in figura:

Da tale figura si può osservare:
1)        Per basse concentrazioni di S, la reazione è praticamente del primo ordine, in quanto la velocità cresce in modo proporzionale all’aumento di S, infatti, essendo l’enzima ancora in forte eccesso rispetto al substrato, la sua concentrazione si può considerare costante;
2)       Per alte concentrazioni di substrato, la velocità tende a un massimo V_max che indica la completa combinazione dell’enzima con il substrato: un ulteriore aumento della concentrazione di questo, non modifica più la velocità di reazione ( reazione di ordine zero); tale valore massimo è solo proporzionale alla concentrazione massima dell’enzima quindi [E]_o:
V_max = K₂[E]_o
Perciò l’equazione di Michaelis-Menden si può anche scrivere:
V = V_max [S]/ K_M+ [S]       (4)
La costante K_M può essere definita nel modo seguente_: se si considera la velocità della reazione corrispondente alla metà di quella massima, cioè:
V = V_max/2
E se si sostituisce nella (4) si ha:
V_max/2 = V_max [S]/ K_M+ [S]
Semplificando V_max ad ambo i membri e moltiplicando per 2 si ha:
1 = 2 [S]/ K_M+ [S]
Moltiplicando ambo i membri per K_M+ [S]   si ottiene:
K_M+ [S] = 2 [S] da cui
K_M =[S]
Cioè la costante di Michaelis-Menden coincide numericamente con la concentrazione di substrato [S] necessaria a raggiungere una velocità di reazione uguale alla metà di quella massima.
La K_M è caratteristica di ogni enzima e indica l’affinità dell’enzima per il suo substrato: più bassa è K_M e più bassa è la concentrazione di S che permette di ottenere la metà della V_max, il che indica che enzima e substrato hanno grande tendenza a reagire; viceversa, un alto valore di K_M significa che occorre alta concentrazione di substrato per raggiungere la metà della V_max( E ed S hanno poca tendenza a reagire).
Riassumendo:
bassa K_M = alta affinità enzima substrato
alta K_M = bassa affinità enzima substrato
L’equazione di Michaelis-Menden si può riportare graficamente in un altro modo che risulta di utile applicazione: se si fa il reciproco della (4) si ottiene:
1/V = K_M/ V_max[S] + 1/V_max
Portando in un grafico 1/V in funzione di 1/[S] ( grafico dei doppi reciproci) , tale funzione è rappresentata da una retta in cui l’intercetta sull’asse delle ascisse è data da – 1/K_M, quella sulle ordinate da 1/V_max e la pendenza è data da K_M/V_max come si può vedere in figura:

 

tale grafico permette di ricavare le grandezze che compaiono nell’equazione di Michaelis-Menden.
La cinetica delle reazioni enzimatiche viene alterata dalla presenza di sostanze dette inibitori, che possono dar origine a tre tipi di inibizione:
-          Inibizione competitiva
-          Inibizione non competitiva
-          Inibizione mista
Nell’inibizione competitiva, l’inibitore, di struttura simile a quella del substrato, va a legarsi nel sito attivo dell’enzima in concorrenza del substrato come si può vedere in figura:

tale fatto diminuisce l’affinità dell’enzima per il substrato: di conseguenza la K_M dell’enzima aumenta in quanto è necessaria una maggiore concentrazione di substrato per ottenere la metà della V_max : quest’ultima invece non viene alterata, poiché se la concentrazione di substrato è molto alta, questo riesce a spostare completamente l’inibitore dal sito attivo e a reagire con la stessa velocità che si avrebbe in assenza di inibitore.
Nel caso dell’inibizione non competitiva, come si può vedere in figura

l’inibitore si lega all’enzima in una zona diversa dal sito attivo il che induce un’alterazione nella struttura dell’enzima e anche il sito attivo risulta deformato e quindi meno idoneo ad accogliere e a reagire con la molecola di substrato: di conseguenza la velocità massima sarà sempre inferiore a quella che si avrebbe in assenza di inibitore, anche con eccesso di substrato, pur mantenendosi inalterato il valore della K_M.
Nell’inibizione mista, un inibitore può legarsi sia all’enzima libero che al complesso enzima-substrato. L’effetto di un inibitore misto sulle costanti cinetiche è diverso a seconda dell’affinità delle due specie enzimatiche ( E ed ES) per l’inibitore.

La V_max risulta sempre ridotta mentre la K_M aumenta se l’affinità di E per l’inibitore è maggiore di quella di ES; viceversa K_M diminuisce se l’affinità di E per l’inibitore è minore di quella di ES