Tecniche di separazione in cromatografia

Le tecniche di separazione in cromatografia sono sostanzialmente tre:
Analisi per eluizione.
Questo metodo, ideato e messo a punto da Reichstein, è certamente il più importante. Esso consiste nel lavare ( o eluire ) la colonna, nella cui testa è stata fatta precedentemente adsorbire o ripartire la miscela di sostanza da separare, con un solvente in modo che le sostanze adsorbite o ripartite passino separatamente nel liquido eluente e quindi man mano escano dalla coda della colonna. In tale liquido esse possono essere sia recuperate sia caratterizzate ed analizzate con i normali metodi chimici d’analisi o con metodi fisici quali spettri infrarossi, ultravioletti, indici di rifrazione ecc.
Per ridurre i tempi di analisi e per migliorare le separazioni sono state apportate successivamente due importanti modifiche al procedimento base.
La prima consiste nell’utilizzare come liquido di sviluppo una serie successiva di solventi appropriati, chiamati eluenti successivi, in modo da ottenere una migliore separazione. La seconda modifica comporta l’applicazione in testa alla colonna di un gradiente di potere eluente ottenuto attraverso una mescolanza progressiva e continua di due opportuni solventi, uno quasi privo di potere eluente, l’altro dotato di altissimo potere eluente.
Con entrambe le tecniche si possono avere dei diagrammi, detti diagrammi di eluizione, ottenuti riportando graficamente le concentrazioni dei soluti nell’eluato in funzione del volume di quest’ultimo. Si ottengono così dei picchi che rappresentano i singoli soluti presenti nella miscela: ciascun picco è caratterizzato da due linee inclinate. Un esempio di diagramma di eluizione è rappresentato in figura:

la separazione dei componenti di una miscela sarà netta quando le due linee inclinate siano molto ripide, cioè quando il gradiente di concentrazione al di qua e al di là del picco sia molto marcato. In generale normalmente la pendenza delle linee non è uguale: una è più ripida, l’altra molto più inclinata con conseguente formazione di un picco asimmetrico.
Ciò limita la qualità della separazione; infatti quando un picco si allarga si può avere sovrapposizione con i picchi adiacenti, per cui ogni frazione è impura dei componenti che la seguono o la precedono nell’ordine di uscita dalla coda della colonna.
Nella pratica per calcolare l’altezza della colonna e il volume di eluente necessari per ottenere una buona separazione dei vari picchi si fa uso di dati sperimentali a disposizione ed in particolare di alcune grandezze sperimentali quali la velocità relativa e la velocità di ritenzione, che sono grandezze specifiche per un dato soluto in determinate condizioni di eluizione.
Queste grandezze corrispondono a una diversa maniera di esprimere la velocità di eluizione di una sostanza.
Volume di ritenzione.
Il volume di ritenzione V_R è il volume di liquido che si raccoglie prima che il soluto appaia alla coda della colonna e incominci l’eluizione propriamente detta. Questa definizione non è universalmente accettata: secondo alcuni, infatti, il volume di ritenzione V’_R è il volume di solvente che si introduce nella colonna fino all’apparire del soluto nell’eluato. Se si indica con V_O il volume della soluzione iniziale la relazione che lega le due grandezze è:
V’_R = V_R – V_O
Il volume di ritenzione è una grandezza legata alle condizioni operative della cromatografia e cioè dalla natura della fase mobile, della fase stazionaria, temperatura, tipo di colonna e metodo di preparazione della colonna stessa.
La velocità relativa R è un’altra grandezza spesso usata. R può essere considerata come il rapporto tra la velocità di avanzamento del soluto e quella del solvente .
Analisi frontale.
Questa tecnica consiste nell’introdurre nella colonna una quantità notevole di soluzione contenente le sostanze da separare in modo che la soluzione stessa funga da eluente.
I soluti si dispongono, durante la migrazione lungo la colonna, in un certo ordine continuo, fissato dall’affinità che essi hanno per la fase stazionaria; in questo stesso ordine sono raccolti all’uscita dalla colonna.
I diagrammi di eluizione, ottenuti riportando la concentrazione totale dei soluti in funzione del volume di eluato raccolto, mostrano un andamento a gradini come si può vedere in figura:

 

il primo gradino corrisponde alla sostanza meno adsorbita che passerà per prima nell’eluato e vi si troverà allo stato puro, mentre il secondo gradino è dovuto alla miscela della prima sostanza e di quella che è immediatamente più adsorbita. Se vi sono più di due gradini l’ultimo gradino corrisponde alla miscela di tutte le sostanze inizialmente presenti, ma non con concentrazione uguale a quella della soluzione originale. Infatti l’ultimo gradino corrisponde a una colonna con una fase stazionaria completamente satura di tutti i componenti della miscela. Questa colonna quindi non scambia più con la soluzione che filtra semplicemente lungo la colonna stessa.
Questo metodo, quindi non si presta né ad un’analisi qualitativa di una miscela, né ad un’analisi quantitativa.
Tuttavia, spesso, è l’unico metodo utilizzabile quando uno o più soluti siano per esempio irreversibilmente adsorbiti su una fase solida. Le curve di eluizione per essere significative devono presentare dei gradini con fronti sufficientemente netti ed è utilizzabile per conoscere solo il numero dei componenti della miscela.
Analisi per spostamento.
L’analisi frontale è stata successivamente modificata al fine di unirne i vantaggi con quelli dell’analisi per eluizione. Tale modifica consiste nell’introdurre nella colonna un volume piccolo e finito di soluzione di una sostanza dotata di una affinità per la fase stazionaria superiore e nell’effettuare poi il lavaggio non già con un solvente puro, ma con una soluzione dotata di una affinità per la fase stazionaria superiore a quella di qualsiasi componente della miscela in esame.
In questo modo le varie sostanze inizialmente presenti nella fase stazionaria vengono spostate e, raggiunto un regime stazionario, si classificano muovendosi lungo la colonna in ordine di affinità per la fase stazionaria.
Anche in questo caso la curva di eluizione sarà a gradini, ma ciascun gradino corrisponderà ad una singola sostanza allo stato puro e non più a una miscela come da figura:


Questo metodo si presta sia all’analisi qualitativa che quantitativa dal momento che ogni gradino è specifico per ciascuna sostanza, mentre la sua altezza è proporzionale alla quantità delle sostanze presenti.
Un inconveniente di tale analisi sta nel fatto che le sostanze corrispondenti ai vari graini lasciano la colonna una dietro l’altra senza che tra esse sia interposto solvente, come invece accade nell’analisi per eluizione. Ciò rende impossibile il recupero quantitativo di ciascun componente della miscela.
Per ovviare a tale inconveniente si è pensato di introdurre nella miscela da eluire nella colonna un certo numero di sostanze scelte in modo che si interpongano tra le singole sostanze da separare.
Questo metodo prende il nome di analisi per spostamento mediante intermediari. Le sostanze intermediarie, oltre a essere dotate di affinità intermedie per la fase stazionaria, devono avere proprietà chimico-fisiche ben diverse da quelle delle sostanze da esaminare al fine di essere facilmente eliminate al termine della separazione, consentendo il recupero quantitativo delle singole frazioni